资料来源:SCH时事通讯
一、研究目的:
甲基苯丙胺(MA)是苯乙胺和苯丙胺的中枢神经系统兴奋剂，常被用作娱乐性药物。近年来，赖对马的虐待在青少年中日益普遍，已成为一个严重的公共卫生问题。
MA滥用不仅引起严重的神经退行性变，增加脑血管意外的风险，而且对生殖系统有很强的毒性。它破坏下丘脑-垂体-睾丸轴的功能，降低黄体生成素(LH)水平，破坏精子功能和睾丸结构，对男性生育能力产生负面影响。除此之外。在交配前、怀孕和哺乳期的雌性大鼠中注射MA也会产生负面的生理和行为影响。此外，还导致人类女性月经周期中断，下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱。
与其他成瘾性药物类似，许多研究表明氧化应激和线粒体损伤可能在MA诱导的遗传毒性和凋亡中起重要作用。这种细胞毒性和遗传毒性可能会加速生殖老化。然而，尚未仔细研究MA对年轻妇女生育能力的潜在不利影响。
一般认为卵巢卵泡衰竭是不可逆的。因此，评价卵巢储备和卵泡衰竭对评价女性生育期长短具有重要意义。抗苗勒管激素(Anti-Mullerian hormone，AMH)是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的成员，由腔前卵泡和有腔卵泡的小颗粒细胞产生。它能抑制原始卵泡的募集和生长卵泡对卵泡刺激素的反应，因此被认为是卵巢储备功能的理想标志物。除AMH外，卵泡计数也是评价卵巢储备功能的重要指标。
虽然青少年接触MA越来越普遍，但关于早期接触MA对女性生育能力和卵巢储备能力的长期影响的研究很少。因此，本研究的目的是探讨成年后长期接触MA的青少年的生育能力和卵巢储备。研究人员提出了青春期女性滥用MA会影响成年后卵巢储备功能和生殖能力的假说。
二、研究方法:
建立雌性青春期马虐鼠模型，从形态学、组织学、生化、激素、行为学等方面进行评价(图1)。
图1
(1)建立雌性青春期马虐鼠模型
ICR雌性小鼠在21±2℃，55±5%湿度和12:12昼夜循环的环境中饲养。腹腔注射MA或0.9%生理盐水，剂量为5mg/kg(n = 24)。从出生后第21天开始，每周连续三天，每天一次，连续八周。这种注入模式模拟了周末人类消费MA的模式。
(2)形态学研究:
①透射电镜观察卵巢颗粒细胞超微结构，步骤如下:卵巢切片-固定-梯度脱水-切块-超微切片-染色-观察-拍照。
②颗粒细胞的光学显微镜形态学观察:采用传统的机械方法从卵巢中分离颗粒细胞。将细胞以1×105细胞/孔的密度接种在6孔板中。在37℃和5% CO2的培养箱中培养2天。光镜下观察颗粒细胞的形态。
(3)分子生物学研究:蛋白质印迹
步骤:蛋白提取、蛋白定量、蛋白变性、凝胶制备、上样电泳、转膜、染色、密封、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、曝光、数据分析。
以β-肌动蛋白为内参，检测AMH、AMHR2、BAX和Bcl-2的蛋白表达。
(4)组织学研究:卵泡计数。
① HE切片:将卵巢组织包埋在石蜡块中-切片-HE染色
②卵泡计数:在光镜下，从卵巢中心最大横截面开始连续3个切片计数各发育阶段的卵泡，计算平均值。切片厚度5μm，间隔25 μ m，为了避免重复计数，只计数含有卵母细胞核的卵泡。根据Myers等(2004)对卵泡进行分类。计算每只小鼠每个切片中不同卵泡的平均数量。整个过程由两名技术人员分别清点了两遍。
(5)卵巢功能研究:激素测定。
细胞在37℃和5% CO2的培养箱中培养2天后，离心收集上清液，用ELISA检测AMH、雌激素和孕酮的浓度。
(6)行为学研究:测定发情周期、交配能力、产仔数和后代体重。
MA处理2周后，用阴道涂片灌洗检查雌性大鼠是否改变了发情周期的规律性和持续时间。当发情周期短于4天或长于5天时，视为不规律。
动物可以隔天交配。两只雌性大鼠和一只未经治疗的雄性大鼠被关在每个笼子里。第二天早上，如果在雌鼠身上观察到精子栓，则确认交配成功。
计算产仔数，并在幼崽出生时称重。
(7)统计分析
采用SPSS 13.0软件包进行统计分析。采用单因素方差分析对蛋白表达、卵泡数、激素水平、周期天数、产仔数和产仔重进行统计比较，并表示平均标准差。卡方检验用于统计比较小鼠的不规则雌激素周期。p
